BAF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401654-ACT

BANF1 codifica il barrier-to-autointegration factor (BAF), una proteina conservata che si lega al DNA e fa da ponte tra il DNA a doppio filamento e le proteine dell’involucro nucleare contenenti il dominio LEM, coordinando l’assemblaggio del nucleo e l’organizzazione della cromatina. BAF partecipa alla riformazione dell’involucro nucleare dopo la mitosi, all’architettura genomica di ordine superiore e alla regolazione dei programmi trascrizionali attraverso interazioni con le lamine e con fattori associati alla cromatina. Attraverso questi ruoli, BANF1 integra vie che governano l’uscita dalla mitosi, la stabilità del genoma e le risposte al danno del DNA. La disregolazione di BANF1/BAF è stata collegata a fenotipi associati alle laminopatie e a difetti della morfologia nucleare, rendendolo un nodo utile per studiare la biologia dell’involucro nucleare e il controllo dell’epigenoma nelle cellule umane.

BAF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BANF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BAF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BANF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BANF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BAF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BANF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BAF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BAF nelle cellule tumorali con espressione di BANF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.