AMPKβ2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-403537-LAC

PRKAB2 codifica la subunità regolatoria β2 della chinasi attivata da AMP (AMP-activated protein kinase, AMPK), un complesso centrale di “sensing” energetico che integra lo stato cellulare di ATP/AMP per coordinare l’omeostasi metabolica. AMPKβ2 contribuisce all’assemblaggio (scaffold) della chinasi eterotrimerica e al targeting dei substrati, oltre a favorire la stabilità del complesso, influenzando così programmi a valle quali ossidazione degli acidi grassi, captazione del glucosio, autofagia e inibizione dei segnali anabolici tramite vie che includono mTOR. Nei tessuti umani, la segnalazione di AMPK interseca la funzione mitocondriale e le risposte allo stress, collegando la regolazione di PRKAB2 a fenotipi rilevanti per l’adattamento metabolico e la sopravvivenza cellulare in condizioni di limitazione dei nutrienti. L’alterazione dell’attività della via di AMPK è stata studiata in contesti quali resistenza all’insulina, disfunzione metabolica associata all’obesità e riprogrammazione metabolica delle cellule tumorali, sostenendo PRKAB2 come nodo meccanicistico nella ricerca sull’omeostasi energetica.

Le particelle di attivazione lentivirale AMPKβ2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di PRKAB2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale AMPKβ2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione PRKAB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di AMPKβ2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo PRKAB2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.