Aldehyde dehydrogenase 2/ALDH2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400809-ACT

ALDH2 umano codifica l’aldeide deidrogenasi mitocondriale 2, un enzima NAD(P)+-dipendente che ossida aldeidi reattive come l’acetaldeide e le aldeidi derivate dalla perossidazione lipidica (per esempio 4-idrossinonenale) nei corrispondenti acidi. Limitando la formazione di addotti aldeidici su proteine, lipidi e DNA, ALDH2 contribuisce all’omeostasi redox mitocondriale, alla proteostasi e alle risposte cellulari allo stress legate alle vie di detossificazione delle ROS. L’attività di ALDH2 è strettamente connessa al metabolismo dell’etanolo e, più in generale, alla rimozione delle aldeidi in contesti cardiometabolici e neurobiologici, in cui una funzione compromessa può aggravare la segnalazione associata al danno ossidativo. La variabilità genetica o una ridotta funzione di ALDH2 sono state associate a una diversa suscettibilità a fenotipi correlati all’alcol e a processi rilevanti per la malattia che coinvolgono disfunzione mitocondriale e infiammazione.

Aldehyde dehydrogenase 2/ALDH2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALDH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Aldehyde dehydrogenase 2/ALDH2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALDH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALDH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Aldehyde dehydrogenase 2/ALDH2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALDH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Aldehyde dehydrogenase 2/ALDH2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Aldehyde dehydrogenase 2/ALDH2 nelle cellule tumorali con espressione di ALDH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.