ABCG8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402453-ACT

ABCG8 codifica un semi-trasportatore della famiglia delle cassette di legame dell’ATP (ABC) che forma un eterodimero con ABCG5, costituendo una pompa di efflusso degli steroli funzionale localizzata sulla membrana apicale degli enterociti e sulla membrana canalicolare degli epatociti. Questo complesso limita l’assorbimento intestinale e promuove l’escrezione biliare degli steroli alimentari, contribuendo all’omeostasi dell’intero organismo per colesterolo e fitosteroli attraverso vie coordinate di trasporto e gestione dei lipidi. L’alterazione dell’attività di ABCG8 compromette il traffico degli steroli ed è associata a profili sterolici plasmatici deregolati e a fenotipi ereditari di accumulo di steroli, incluse presentazioni simili alla sitosterolemia. Di conseguenza, ABCG8 è ampiamente studiato nella regolazione metabolica, nella biologia del trasporto lipidico e nelle relazioni genotipo–fenotipo del metabolismo degli steroli.

ABCG8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABCG8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ABCG8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABCG8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABCG8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ABCG8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABCG8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ABCG8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ABCG8 nelle cellule tumorali con espressione di ABCG8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.