ABCA4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401830-ACT

ABCA4 codifica un trasportatore della famiglia ATP-binding cassette (ABC) espresso prevalentemente nei fotorecettori retinici, dove si localizza nelle membrane dei dischi del segmento esterno e svolge una funzione nel ciclo visivo. ABCA4 media il trasporto, dipendente dall’ATP, di coniugati retinoidici, contribuendo a rimuovere la N-retinilidene-fosfatidiletanolammina e intermedi correlati per limitare l’accumulo di bisretinoidi citotossici come l’A2E. Attraverso il suo ruolo nella gestione dei retinoidi, ABCA4 sostiene l’omeostasi dei fotorecettori e si intreccia con vie che regolano il trasporto lipidico, lo stress ossidativo e le interazioni tra epitelio pigmentato retinico e fotorecettori. La disregolazione o la ridotta attività di ABCA4 è fortemente associata a degenerazioni retiniche ereditarie, tra cui la malattia di Stargardt e la distrofia cono-bastoncellare correlata ad ABCA4, rendendolo un bersaglio chiave per studi meccanicistici della patobiologia retinica.

ABCA4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABCA4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ABCA4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABCA4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABCA4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ABCA4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABCA4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ABCA4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ABCA4 nelle cellule tumorali con espressione di ABCA4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.