β1-Adaptin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402948-ACT

AP1B1 codifica la β1-adattina, una subunità centrale del complesso adattatore proteico 1 (AP-1), che accoppia il riconoscimento del carico alla formazione di vescicole mediata dalla clatrina nel trans-Golgi network e negli endosomi. Legandosi a motivi di smistamento presenti nelle proteine transmembrana, AP-1 coordina il traffico polarizzato, il riciclo endosomiale e il mantenimento della composizione della membrana nelle cellule epiteliali e neuronali. L’alterazione del trasporto dipendente da AP-1 compromette la localizzazione dei recettori e gli output di segnalazione, collegando la disfunzione di AP1B1 a difetti della polarità cellulare, dei processi neuroevolutivi e dell’omeostasi delle proteine di membrana. In quanto nodo centrale del traffico intracellulare, la β1-adattina è spesso studiata nel contesto della dinamica endosoma–Golgi, della fedeltà dello smistamento del carico e della comunicazione tra organelli.

β1-Adaptin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AP1B1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β1-Adaptin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AP1B1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AP1B1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β1-Adaptin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AP1B1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β1-Adaptin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β1-Adaptin nelle cellule tumorali con espressione di AP1B1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.