α-actinin-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400548-ACT

ACTN4 codifica l’α-actinina-4, una proteina legante l’actina sensibile al calcio che reticola l’actina filamentosa e ancora le reti del citoscheletro ai complessi di adesione. Si localizza alle fibre di stress, alle adesioni focali e a strutture dinamiche ricche di actina per regolare la forma cellulare, le forze di trazione e processi guidati dal citoscheletro, inclusi migrazione e citocinesi. Attraverso i suoi ruoli nel rimodellamento dell’actina e nella segnalazione mediata dall’adesione, l’α-actinina-4 influenza vie che controllano la meccanotrasduzione e la motilità cellulare. Un’espressione o una funzione deregolata di ACTN4 è stata associata a un’alterata invasività cellulare e a disfunzione dei podociti renali, a supporto della sua rilevanza negli studi sui meccanismi di malattia legati al citoscheletro.

α-actinin-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACTN4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α-actinin-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACTN4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACTN4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α-actinin-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACTN4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α-actinin-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α-actinin-4 nelle cellule tumorali con espressione di ACTN4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.