Zyxin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402295-ACT

Lo ZYX umano codifica la zyxin, una proteina scaffold con dominio LIM delle adesioni focali che coordina il rimodellamento del citoscheletro di actina e la meccanotrasduzione nei siti di adesione mediata dalle integrine. La zyxin interagisce con VASP/EVL e con l’α-actinina per sostenere il mantenimento delle fibre di stress, lo spreading cellulare e la migrazione direzionale, collegando i segnali della matrice extracellulare alla contrattilità regolata dalle GTPasi Rho e ai programmi responsivi a YAP/TAZ. Grazie al suo traffico tra i complessi di adesione e il nucleo, la zyxin può influenzare le risposte trascrizionali allo stress meccanico e alle perturbazioni del citoscheletro. Un’espressione o una localizzazione alterata di ZYX è stata associata a segnali di adesione modificati e a fenotipi invasivi in modelli correlati al cancro, nonché a ruoli più ampi nel rimodellamento tissutale, dove le dinamiche cellula-matrice sono cruciali.

Zyxin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZYX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Zyxin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZYX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZYX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Zyxin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZYX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Zyxin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Zyxin nelle cellule tumorali con espressione di ZYX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.