Wnt-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401418-ACT

WNT4 codifica Wnt-4, un ligando glicoproteico secreto che regola le decisioni sul destino cellulare, la polarità, la migrazione e la differenziazione attraverso la segnalazione Wnt. Wnt-4 interagisce con i recettori Frizzled/LRP per modulare la trascrizione dipendente dalla β-catenina, oltre alle vie Wnt non canoniche della polarità cellulare planare e del Ca2+, plasmando i programmi di sviluppo e l’omeostasi tissutale. Nella biologia umana, l’attività di WNT4 è strettamente legata allo sviluppo del tratto riproduttivo e del rene ed è stata implicata in fenotipi endocrini e metabolici; più in generale, la deregolazione della segnalazione Wnt è ampiamente associata a proliferazione aberrante, fibrosi e biologia tumorale. Queste caratteristiche rendono WNT4 un nodo utile per analizzare il crosstalk tra vie di segnalazione con TGF-β, MAPK e Hippo/YAP in modelli specifici per contesto.

Wnt-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WNT4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WNT4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WNT4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WNT4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-4 nelle cellule tumorali con espressione di WNT4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.