Wnt-10b Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-423710-ACT-2

Il gene murino Wnt10b codifica la glicoproteina secreta Wnt-10b, un ligando canonico della via Wnt che attiva i complessi recettoriali Frizzled/LRP promuovendo la stabilizzazione della β-catenina e la trascrizione dipendente da TCF/LEF. Wnt-10b regola il patterning embrionale e l’omeostasi dei tessuti adulti controllando le decisioni di destino cellulare, la proliferazione e la differenziazione, con ruoli ben documentati nell’osteoblastogenesi, nella soppressione dell’adipogenesi e nella biologia del follicolo pilifero e della ghiandola mammaria. Una segnalazione Wnt10b deregolata è stata associata ad alterazioni della massa ossea, a fenotipi metabolici e del tessuto adiposo e, in modo dipendente dal contesto, all’attivazione della via Wnt correlata ai tumori, rendendola un bersaglio utile per studi meccanicistici delle dinamiche Wnt/β-catenina. L’editing genetico di Wnt10b in cellule o modelli murini consente l’analisi funzionale della segnalazione Wnt specifica del ligando, del crosstalk tra vie, e di fenotipi di sviluppo o metabolici mediante saggi reporter, sistemi di differenziazione e analisi in vivo delle linee cellulari.

Wnt-10b Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Wnt10b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-10b Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Wnt10b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Wnt10b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-10b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Wnt10b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-10b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-10b nelle cellule tumorali con espressione di Wnt10b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.