vinculin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400227-ACT

Il gene umano **VCL** codifica la vinculina, un adattatore meccanosensibile che lega l’actina ed è arricchito nelle adesioni focali e nelle giunzioni aderenti, dove collega i complessi di integrine e caderine al citoscheletro di actina. La vinculina regola la dinamica dell’adesione cellula–MEC e cellula–cellula, la trasmissione delle forze e il rimodellamento del citoscheletro tramite vie che coinvolgono talina, paxillina, la segnalazione FAK/Src e le GTPasi della famiglia Rho. Modulando il turnover delle adesioni e le forze di trazione, **VCL** influenza migrazione, polarità e morfogenesi tissutale; la sua disregolazione è oggetto di studio in contesti di invasività alterata e potenziale metastatico. La meccanotrasduzione dipendente da **VCL** è rilevante anche in modelli di adesione dei cardiomiociti e di accoppiamento contrattile, in cui cambiamenti nell’integrità delle giunzioni possono influire sulle risposte allo stress.

vinculin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VCL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

vinculin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VCL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VCL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di vinculin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VCL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da vinculin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via vinculin nelle cellule tumorali con espressione di VCL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.