VAMP-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402306-ACT

VAMP3 codifica la proteina di membrana associata alle vescicole 3 (VAMP-3), una v-SNARE che media gli eventi di fusione di membrana necessari per il riciclo endocitico e l’esocitosi regolata. Si localizza prevalentemente negli endosomi di riciclo e supporta il traffico di recettori e trasportatori verso la membrana plasmatica, coordinando processi quali la migrazione cellulare, il turnover dell’adesione e la secrezione di citochine o enzimi. VAMP-3 partecipa all’assemblaggio del complesso SNARE con le sintassine e le proteine SNAP, collegando il trasporto vescicolare al rimodellamento del citoscheletro e alla funzione delle cellule immunitarie. Un traffico vescicolare deregolato che coinvolge VAMP-3 è stato associato ad alterazioni della segnalazione infiammatoria, all’ingresso/uscita di patogeni e a fenotipi metastatici, rendendolo rilevante per studi sull’immunità innata, sulla biologia delle infezioni e sull’invasione delle cellule tumorali.

VAMP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VAMP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VAMP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VAMP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VAMP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VAMP-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VAMP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VAMP-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VAMP-3 nelle cellule tumorali con espressione di VAMP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.