V-ATPase C1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402679-ACT

ATP6V1C1 codifica la subunità C1 del dominio periferico V1 della H+-ATPasi vacuolare (V-ATPasi), una pompa protonica dipendente dall’ATP che acidifica endosomi, lisosomi e vescicole secretorie. Supportando l’acidificazione degli organelli, la V-ATPasi C1 contribuisce all’endocitosi mediata da recettore, al flusso autofagico, all’attività degli enzimi lisosomiali e alla segnalazione di sensing dei nutrienti di mTORC1 sulla membrana lisosomiale. Un’alterazione della funzione della V-ATPasi può compromettere l’omeostasi del pH intracellulare, il traffico vescicolare e la proteostasi, processi spesso studiati in contesti quali la neurodegenerazione, il metabolismo delle cellule tumorali e l’attivazione delle cellule immunitarie. ATP6V1C1 rappresenta quindi un nodo utile per analizzare i percorsi che collegano l’acidificazione degli organelli alla segnalazione e alle risposte cellulari allo stress.

V-ATPase C1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP6V1C1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

V-ATPase C1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP6V1C1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP6V1C1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di V-ATPase C1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP6V1C1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da V-ATPase C1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via V-ATPase C1 nelle cellule tumorali con espressione di ATP6V1C1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.