USP9X Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402285-ACT

USP9X (ubiquitin-specific peptidase 9, legata al cromosoma X) è un enzima deubiquitinante che regola la stabilità delle proteine e l’output di segnalazione rimuovendo catene di ubiquitina dalle proteine bersaglio. Influenza la proteostasi, il traffico endocitico e le vie di risposta allo stress, ed è stata collegata alla modulazione dell’apoptosi, al controllo del ciclo cellulare e alle risposte al danno al DNA attraverso la stabilizzazione, dipendente dal contesto, di componenti chiave della segnalazione. L’attività di USP9X interseca le reti ubiquitina–proteasoma e autofagia, plasmando le decisioni cellulari di differenziamento e sopravvivenza. Un’espressione o una funzione deregolata di USP9X è stata associata a diversi tumori e a fenotipi neurosviluppo, rendendola un bersaglio rilevante per studi meccanicistici della segnalazione mediata dall’ubiquitina nelle cellule umane.

USP9X Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP9X senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP9X Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP9X nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP9X, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP9X. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP9X nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP9X nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP9X nelle cellule tumorali con espressione di USP9X silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.