USP45 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-429548-ACT-2

Il gene murino Usp45 codifica USP45, una proteasi specifica per l’ubiquitina che rimuove le modificazioni di ubiquitinazione dalle proteine bersaglio per regolarne la stabilità e l’output di segnalazione. USP45 è implicata nella risposta al danno al DNA, sostenendo il mantenimento del genoma attraverso eventi di deubiquitinazione che influenzano la scelta delle vie di riparo e la tolleranza allo stress replicativo, anche mediante il coordinamento con reti di modificazioni post-traduzionali come la segnalazione dell’ubiquitina e di SUMO. L’alterazione della deubiquitinazione mediata da USP45 può perturbare i processi di riparo associati alla cromatina, aumentare l’instabilità genomica ed è stata collegata a fenotipi rilevanti per la biologia del cancro e a difetti dello sviluppo. Studi di editing genetico mirato su Usp45 e di genomica funzionale in cellule murine consentono di analizzare i meccanismi dei circuiti di riparo del DNA dipendenti dall’ubiquitina, identificare i substrati e i partner di interazione di USP45 e modellare le relazioni genotipo–fenotipo nelle vie che garantiscono l’integrità del genoma.

USP45 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Usp45 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP45 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Usp45 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Usp45, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP45. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Usp45 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP45 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP45 nelle cellule tumorali con espressione di Usp45 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.