USP4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403543-ACT

La peptidasi 4 specifica per l’ubiquitina (USP4) è un enzima deubiquitinante che regola la stabilità proteica e l’output dei segnali rimuovendo catene di ubiquitina dai substrati bersaglio. Nelle cellule umane, USP4 modula vie chiave tra cui la segnalazione TGF-β/SMAD, le risposte infiammatorie collegate a NF-κB e il traffico dei recettori, influenzando così programmi trascrizionali, proteostasi e processi di adattamento allo stress. Attraverso i suoi effetti sul turnover dipendente dall’ubiquitina, USP4 contribuisce al controllo della proliferazione cellulare, dell’apoptosi e della dinamica della segnalazione immunitaria. Un’attività o un’espressione deregolate di USP4 sono state associate ad alterazioni dell’omeostasi dei segnali nella biologia dei tumori e nei meccanismi delle malattie infiammatorie, rendendola un nodo rilevante per l’analisi delle vie di segnalazione.

USP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP4 nelle cellule tumorali con espressione di USP4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.