UGCG Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403055-ACT

UGCG umano codifica la UDP-glucosio:ceramide glucosiltransferasi, una glicosiltransferasi localizzata nell’apparato di Golgi che catalizza il primo passaggio irreversibile della biosintesi dei glicosfingolipidi convertendo la ceramide in glucosilceramide. Questa reazione regola l’equilibrio cellulare della ceramide e sostiene la produzione a valle di glicosfingolipidi complessi, che influenzano l’organizzazione dei microdomini di membrana, la segnalazione dei recettori, il traffico vescicolare e le interazioni cellula–cellula. L’attività di UGCG si intreccia con il metabolismo degli sfingolipidi e con le vie di risposta allo stress, modulando processi quali la differenziazione, la suscettibilità all’apoptosi e la segnalazione infiammatoria. Un’omeostasi dei glicosfingolipidi deregolata che coinvolge UGCG è stata associata a fenotipi neurodegenerativi e metabolici ed è stata studiata anche in ambito oncologico, dove alterazioni della segnalazione lipidica possono modulare proliferazione e risposta ai farmaci.

UGCG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UGCG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UGCG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UGCG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UGCG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UGCG. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UGCG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UGCG nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UGCG nelle cellule tumorali con espressione di UGCG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.