U2AF65 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402059-ACT

L’U2AF2 umano codifica U2AF65, un componente essenziale del fattore ausiliario di splicing U2 che riconosce il tratto polipirimidinico nei siti di splicing 3′ e promuove il reclutamento dello snRNP U2 durante lo splicing del pre-mRNA. Attraverso i suoi motivi di riconoscimento dell’RNA e le interazioni con i partner dello splicing, U2AF65 contribuisce a definire i confini esone–introne e a coordinare l’assemblaggio dello spliceosoma, influenzando i programmi di splicing alternativo e l’integrità del trascrittoma. Lo splicing dipendente da U2AF2 è strettamente accoppiato al controllo dell’espressione genica e può modulare vie coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare, nelle risposte al danno al DNA e nel metabolismo dell’RNA. Un’espressione deregolata di U2AF2 o uno squilibrio nella rete dei fattori di splicing è stato associato a un uso aberrante delle isoforme osservato in molteplici contesti di cancro e malattie ematologiche, rendendolo un bersaglio rilevante per studi meccanicistici dei fenotipi guidati dallo splicing.

U2AF65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di U2AF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

U2AF65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus U2AF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione U2AF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di U2AF65. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus U2AF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da U2AF65 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via U2AF65 nelle cellule tumorali con espressione di U2AF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.