TTC36 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431423-ACT

Il gene murino Ttc36 codifica TTC36, una proteina contenente ripetizioni tetratricopeptidiche (TPR) che si prevede agisca da impalcatura (scaffold) per complessi multiproteici in grado di coordinare le interazioni proteina–proteina. Le proteine con dominio TPR influenzano comunemente la proteostasi, il traffico intracellulare e la segnalazione modulando l’interazione con gli chaperoni e l’assemblaggio di complessi regolatori. Sebbene TTC36 rimanga caratterizzata solo parzialmente, studi basati su espressione e genetica possono chiarirne il contributo a programmi di controllo dello stato cellulare, quali la risposta allo stress, la differenziazione e l’omeostasi tissutale. La disregolazione della formazione di complessi mediata dai TPR è spesso implicata in fenotipi associati a patologie, rendendo Ttc36 un bersaglio utile per esplorazioni meccanicistiche in modelli murini.

TTC36 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ttc36 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TTC36 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ttc36 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ttc36, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TTC36. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ttc36 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TTC36 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TTC36 nelle cellule tumorali con espressione di Ttc36 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.