TRPV6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402632-ACT

TRPV6 codifica un canale epiteliale altamente selettivo per Ca²⁺ della famiglia dei TRP vanilloidi, che media l’ingresso di calcio attraverso la membrana plasmatica. Regolando la segnalazione citosolica del Ca²⁺, TRPV6 influenza programmi trascrizionali calcio-dipendenti, il trasporto epiteliale e la differenziazione cellulare. L’attività di TRPV6 si integra con vie a valle dell’afflusso di calcio, incluse la segnalazione dipendente dalla calmodulina e reti più ampie di omeostasi ionica. Un’espressione deregolata di TRPV6 e alterazioni nella gestione del calcio sono state associate a patofisiologia epiteliale e a fenotipi correlati al cancro, supportandone l’impiego come nodo meccanicistico in studi su proliferazione, invasione e segnalazione regolata dagli ormoni.

TRPV6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPV6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPV6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPV6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPV6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPV6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPV6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPV6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPV6 nelle cellule tumorali con espressione di TRPV6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.