TRPM8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401744-ACT

TRPM8 (transient receptor potential cation channel subfamily M member 8) è un canale ionico permeabile al calcio, sensibile al freddo e al mentolo, che regola l’eccitabilità di membrana e la segnalazione intracellulare del Ca2+. Nelle cellule umane, l’attività di TRPM8 influenza la trasduzione sensoriale, la risposta osmotica e termica e le vie a valle collegate alla regolazione trascrizionale e alla segnalazione tramite chinasi dipendenti dal Ca2+. Alterazioni dell’espressione o della funzione di TRPM8 sono state associate a cambiamenti nella segnalazione neuronale e nel comportamento delle cellule epiteliali, e TRPM8 è spesso studiato nel contesto della biologia dei tumori, del dolore e dei disturbi sensoriali, nonché dei processi associati all’infiammazione. In quanto canale della membrana plasmatica, TRPM8 rappresenta un nodo sperimentalmente accessibile per analizzare come la regolazione dipendente dai canali ionici influenzi lo stato cellulare, la migrazione e le dinamiche di segnalazione evocate da stimoli.

TRPM8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPM8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPM8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPM8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPM8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPM8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPM8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPM8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPM8 nelle cellule tumorali con espressione di TRPM8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.