TRPM5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403223-ACT

TRPM5 codifica un canale cationico monovalente attivato dal calcio della famiglia dei recettori potenziali transitori melastatina, che accoppia i segnali intracellulari di Ca2+ alla depolarizzazione di membrana. È un mediatore chiave della trasduzione chemosensoriale nelle cellule recettrici del gusto e contribuisce all’amplificazione del segnale a valle delle vie GPCR–PLCβ2–IP3–Ca2+, modulando l’eccitabilità elettrica. L’attività di TRPM5 influenza la secrezione e l’eccitabilità dipendenti dallo stimolo in specifici contesti epiteliali ed endocrini, collegando la dinamica del Ca2+ ai programmi di risposta cellulare. Alterazioni dell’espressione di TRPM5 o della funzione del canale sono state studiate in relazione a fenotipi sensoriali e, più in generale, a stati di segnalazione metabolica e infiammatoria nei tessuti umani.

TRPM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPM5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPM5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPM5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPM5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPM5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPM5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPM5 nelle cellule tumorali con espressione di TRPM5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.