TPCN2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402960-ACT

TPCN2 (two-pore segment channel 2) codifica un canale cationico endolisosomiale che regola il rilascio di Ca²⁺ da compartimenti intracellulari acidi in risposta a NAADP e a segnali correlati, coordinando il traffico di membrana, l’eccitabilità degli organelli e la fusione delle vescicole. Modellando la dinamica endosoma–lisosoma e l’omeostasi ionica, TPCN2 influenza l’autofagia, il riciclo dei recettori e i processi di sensing dei nutrienti collegati alla segnalazione mTOR. Un’alterata attività di TPCN2 è stata associata a cambiamenti nella biologia della pigmentazione, a fenotipi metabolici e a programmi di invasione cellulare, rendendolo rilevante per gli studi sulla funzione lisosomiale e sull’adattamento allo stress. Studiare TPCN2 offre un modo per chiarire come la segnalazione endolisosomiale del Ca²⁺ si interfacci con il rimodellamento del citoscheletro e il crosstalk tra organelli nelle cellule umane.

TPCN2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TPCN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TPCN2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TPCN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TPCN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TPCN2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TPCN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TPCN2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TPCN2 nelle cellule tumorali con espressione di TPCN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.