Plásmido CRISPR de Activación (h) TLR4: sc-400068-ACT

El TLR4 humano (receptor tipo Toll 4) es un receptor de reconocimiento de patrones que detecta lipopolisacárido y otros patrones moleculares asociados a patógenos y a daño en la membrana plasmática. Tras la unión del ligando con correceptores como MD-2 y CD14, TLR4 inicia cascadas de señalización dependientes de MyD88 y de TRIF que activan NF-κB, AP-1 e IRF3, impulsando programas transcripcionales de citocinas inflamatorias y respuestas de interferón de tipo I. Estas vías coordinan la activación de la inmunidad innata, el reclutamiento de leucocitos y la comunicación con la inmunidad adaptativa a través de células presentadoras de antígeno. La señalización desregulada de TLR4 se ha implicado en estados inflamatorios crónicos y en patología inmunomediada, y se estudia ampliamente en contextos que incluyen la biología de la sepsis, la aterosclerosis, la inflamación metabólica y la inflamación asociada a tumores.

TLR4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TLR4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TLR4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TLR4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TLR4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TLR4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TLR4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TLR4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TLR4 en células tumorales con expresión de TLR4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.