TIMP-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400685-ACT

Il gene umano **TIMP2** codifica l’inibitore tissutale delle metalloproteinasi-2 (TIMP-2), un regolatore secreto del turnover della matrice extracellulare che modula l’attività delle metalloproteinasi della matrice, inclusa l’inibizione di MMP2, e influenza il rimodellamento dipendente dalle proteasi. Bilanciando la degradazione della matrice mediata dalle metalloproteinasi con la loro inibizione, TIMP-2 condiziona la migrazione e l’adesione cellulare, nonché l’architettura tissutale, collegandosi a vie che governano invasione, angiogenesi e riparazione delle ferite. TIMP-2 contribuisce inoltre al controllo della proteolisi pericellulare attraverso interazioni con fattori associati alla membrana come MT1-MMP, influenzando così segnali nel microambiente tumorale e il rimodellamento fibrotico. Una deregolazione dell’espressione di TIMP2 è stata associata ad alterazioni della dinamica della MEC osservate nella biologia dei tumori, negli stati infiammatori e nei disturbi del tessuto connettivo, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici di fenotipi dipendenti dalla matrice.

TIMP-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TIMP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIMP-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TIMP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TIMP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIMP-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TIMP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIMP-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIMP-2 nelle cellule tumorali con espressione di TIMP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.