Thrombospondin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401207-ACT

THBS2 codifica la trombospondina 2, una glicoproteina matricellulare secreta che modula l’organizzazione della matrice extracellulare, l’adesione cellula–matrice e il rimodellamento tissutale. La trombospondina 2 influenza la segnalazione associata a integrine e CD36, regola l’attività delle metalloproteinasi della matrice e modella le risposte angiogeniche e infiammatorie all’interno del microambiente stromale. Attraverso questi processi, THBS2 viene comunemente studiato in contesti di fibrosi, riparazione delle ferite e interazioni tumore–stroma, in cui la dinamica della matrice extracellulare controlla la migrazione e la sopravvivenza cellulare. Un’espressione alterata di THBS2 è stata associata a un rimodellamento vascolare anomalo e a una disregolazione della matrice extracellulare rilevanti per molteplici stati fisiopatologici.

Thrombospondin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di THBS2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Thrombospondin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus THBS2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione THBS2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Thrombospondin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus THBS2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Thrombospondin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Thrombospondin 2 nelle cellule tumorali con espressione di THBS2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.