TFE3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401179-ACT

TFE3 (fattore di trascrizione E3) è un fattore di trascrizione della famiglia MiT/TFE con dominio basic helix–loop–helix e leucine zipper, che si lega ai motivi E-box per coordinare programmi che controllano la biogenesi lisosomiale, l’autofagia e il metabolismo cellulare. Integra segnali nutrizionali e di stress tramite interazioni con la regolazione dipendente da mTORC1 e coopera con le reti geniche lisosomiali guidate da TFEB/TFE3 per modulare il traffico vescicolare e il metabolismo ossidativo. Nella biologia delle malattie umane, un’attività alterata di TFE3 è associata a una proteostasi deregolata e a risposte immunitarie innate anomale, e fusioni del gene TFE3 o la sua sovraespressione sono ricorrenti in sottogruppi di carcinoma a cellule renali e in altre neoplasie. Queste proprietà rendono TFE3 un nodo utile per analizzare il controllo trascrizionale delle vie cataboliche e dell’omeostasi degli organelli.

TFE3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TFE3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TFE3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TFE3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TFE3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TFE3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TFE3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TFE3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TFE3 nelle cellule tumorali con espressione di TFE3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.