TARC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401905-ACT

CCL17 codifica la chemochina timica e regolata dall’attivazione (TARC), una chemochina CC secreta che promuove la migrazione direzionale di cellule T che esprimono CCR4, incluse sottopopolazioni polarizzate Th2, verso i siti di infiammazione. Modellando il traffico leucocitario e la comunicazione tra cellule dendritiche e cellule T, TARC contribuisce al posizionamento delle cellule immunitarie nei tessuti e al coordinamento di risposte guidate dalle citochine all’interno della rete di segnalazione delle chemochine. L’espressione deregolata di CCL17/TARC è spesso studiata nell’infiammazione allergica e in altre patologie immuno-mediate, in cui gradienti chemiotattici alterati influenzano l’infiltrazione immunitaria e il rimodellamento tissutale. Nei sistemi modello umani, CCL17 rappresenta un readout facilmente misurabile dell’attivazione dei circuiti infiammatori e un nodo utile per interrogare il comportamento dell’asse chemochina–recettore.

TARC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCL17 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TARC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCL17 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCL17, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TARC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCL17 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TARC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TARC nelle cellule tumorali con espressione di CCL17 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.