TANK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402464-ACT

TANK (attivatore di NF-κB associato ai membri della famiglia TRAF) è una proteina adattatrice e di “scaffold” citosolica che coordina la trasduzione del segnale a valle dei recettori dell’immunità innata e dell’infiammazione. Interagisce con le proteine TRAF e con chinasi come TBK1 e i complessi IKK per modulare la trascrizione dipendente da NF-κB e IRF, influenzando le risposte interferoniche, la produzione di citochine e i programmi di sopravvivenza cellulare. Attraverso queste connessioni di via, TANK contribuisce alla regolazione della difesa antivirale e dell’omeostasi infiammatoria e la sua disregolazione è rilevante negli studi sullo squilibrio della segnalazione immunitaria e sui meccanismi patologici associati all’infiammazione. Nelle cellule umane, un’attività alterata della rete dipendente da TANK può essere sfruttata per indagare il cross-talk tra NF-κB, la segnalazione dell’interferone di tipo I e le vie di risposta allo stress.

TANK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TANK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TANK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TANK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TANK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TANK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TANK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TANK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TANK nelle cellule tumorali con espressione di TANK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.