T2R38 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402279-ACT

TAS2R38 codifica il recettore del gusto amaro T2R38, un GPCR che rileva ligandi contenenti tiourea e trasduce il segnale attraverso le vie gustative canoniche, che includono l’attivazione della fosfolipasi Cβ2 mediata da proteine G, la mobilizzazione intracellulare di Ca²⁺ e la depolarizzazione a valle dipendente da TRPM5. Oltre alla percezione del gusto nella cavità orale, T2R38 è espresso anche in epiteli extraorali, dove può influenzare la segnalazione chemosensoriale e programmi cellulari associati alla difesa innata. Polimorfismi codificanti comuni modificano la responsività del recettore e sono stati ampiamente utilizzati per studiare le differenze interindividuali nella percezione dell’amaro e nella biologia chemosensoriale. Queste caratteristiche rendono TAS2R38 un modello utile per indagare la dinamica della segnalazione dei GPCR, le vie di sensing epiteliale e le relazioni genotipo–fenotipo.

T2R38 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TAS2R38 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

T2R38 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TAS2R38 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TAS2R38, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di T2R38. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TAS2R38 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da T2R38 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via T2R38 nelle cellule tumorali con espressione di TAS2R38 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.