SV2C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402877-ACT

La glicoproteina 2C delle vescicole sinaptiche (SV2C) è una proteina di membrana multipasso localizzata nelle vescicole sinaptiche e in compartimenti secretori correlati, dove contribuisce alla regolazione del traffico vescicolare, del priming e del rilascio di neurotrasmettitori accoppiato allo stimolo. Nei neuroni, le proteine della famiglia SV2 interagiscono con i componenti principali della macchina esocitotica e influenzano il ciclo delle vescicole sinaptiche e l’efficienza della neurotrasmissione, con effetti sulla segnalazione a livello di circuito. Nell’uomo SV2C è arricchita nelle vie catecolaminergiche ed è stata collegata alla funzione delle sinapsi dopaminergiche, risultando quindi rilevante per studi sulla vulnerabilità neuronale e sulla disfunzione sinaptica. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di SV2C sono state associate a fenotipi neurodegenerativi e neuropsichiatrici in dataset genetici e funzionali, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico nella ricerca sulla biologia sinaptica.

SV2C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SV2C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SV2C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SV2C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SV2C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SV2C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SV2C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SV2C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SV2C nelle cellule tumorali con espressione di SV2C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.