Smurf2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401431-ACT

SMURF2 codifica Smurf2, una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio HECT che regola il turnover proteico catalizzando l’ubiquitinazione di componenti della segnalazione e del ciclo cellulare. Smurf2 è nota soprattutto per la modulazione della segnalazione TGF-β/BMP tramite il controllo, dipendente dall’ubiquitina, dei mediatori della via, influenzando così la transizione epitelio-mesenchimale, la differenziazione e l’omeostasi tissutale. Interagisce anche con le risposte al danno al DNA e con programmi associati alla senescenza, collegando la segnalazione dell’ubiquitina alla stabilità del genoma e all’adattamento allo stress. Un’attività di SMURF2 deregolata e un’alterazione dell’equilibrio tra vie sono state associate a cambiamenti dipendenti dal contesto nella progressione tumorale, nella segnalazione legata alla fibrosi e in fenotipi infiammatori, rendendola un nodo utile per studi meccanicistici sul crosstalk tra vie di segnalazione.

Smurf2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMURF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Smurf2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMURF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMURF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Smurf2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMURF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Smurf2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Smurf2 nelle cellule tumorali con espressione di SMURF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.