SmcX Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423030-ACT

Kdm5c (SmcX) codifica una demetilasi istonica legata al cromosoma X contenente un dominio Jumonji C (JmjC), che rimuove i segni H3K4me2/3, modulando l’accessibilità della cromatina e i programmi trascrizionali durante lo sviluppo. Nelle cellule di topo, SmcX regola il controllo epigenetico dell’espressione genica associata alla differenziazione neuronale, alla funzione sinaptica e alla trascrizione dipendente dall’attività, interfacciandosi con vie di segnalazione che governano le decisioni di destino cellulare e gli stati dei promotori/enhancer a livello genomico. L’alterazione o la disregolazione di KDM5C è associata a fenotipi neuroevolutivi e a cambiamenti della funzione cognitiva, in linea con il suo ruolo nel mantenere un’adeguata omeostasi trascrizionale. SmcX è quindi un bersaglio utile per studiare la regolazione guidata dalla cromatina, le reti geniche neuronali e i contributi epigenetici a stati cellulari rilevanti per la malattia.

SmcX Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Kdm5c senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SmcX Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Kdm5c nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Kdm5c, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SmcX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Kdm5c nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SmcX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SmcX nelle cellule tumorali con espressione di Kdm5c silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.