SmcX Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405760-ACT

Il gene umano **KDM5C** codifica il regolatore della cromatina **SmcX**, una demetilasi istonica contenente il dominio **Jumonji C (JmjC)** che rimuove preferenzialmente la metilazione di **H3K4** per modellare i programmi trascrizionali. Modulando gli stati della cromatina a livello di promotori ed enhancer, SmcX influenza l’espressione genica dipendente dalla **RNA polimerasi II**, la differenziazione neuronale e il controllo trascrizionale legato al ciclo cellulare. L’attività di KDM5C interagisce con vie epigenetiche che coordinano l’accessibilità della cromatina, le risposte al danno del DNA e la regolazione genica specifica di linea cellulare. La deregolazione o le mutazioni di KDM5C sono state associate a fenotipi di neurosviluppo e a un’alterata omeostasi trascrizionale, alimentando studi meccanicistici sulla biologia delle malattie guidata dalla cromatina.

SmcX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KDM5C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SmcX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KDM5C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KDM5C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SmcX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KDM5C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SmcX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SmcX nelle cellule tumorali con espressione di KDM5C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.