SLP-76 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401421-ACT

LCP2 codifica SLP-76, una proteina adattatrice citosolica essenziale per collegare l’attivazione degli immunorecettori alla segnalazione a valle nelle cellule ematopoietiche. In seguito alla stimolazione del recettore delle cellule T o dei recettori Fc, SLP-76 funge da piattaforma per l’assemblaggio di complessi multiproteici con LAT, VAV1, ITK e PLCγ, coordinando cascate di fosforilazione che regolano il flusso di calcio, l’attivazione delle MAPK, il rimodellamento del citoscheletro e programmi trascrizionali che governano l’attivazione e la differenziazione dei linfociti. Attraverso queste vie, SLP-76 influenza l’adesione mediata dalle integrine, la formazione della sinapsi immunologica e le risposte effettrici, rendendola un nodo centrale per lo studio della dinamica della segnalazione dei recettori per l’antigene. Una segnalazione prossimale deregolata che coinvolge le reti associate a SLP-76 è rilevante per disfunzioni immunitarie e fenotipi infiammatori, a supporto del suo impiego in modelli meccanicistici della segnalazione nelle cellule immunitarie.

SLP-76 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LCP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SLP-76 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LCP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LCP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SLP-76. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LCP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SLP-76 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SLP-76 nelle cellule tumorali con espressione di LCP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.