Skint8 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-437039-ACT-2

Mouse Skint8 (selection and upkeep of intraepithelial T cells protein 8) è un membro della famiglia SKINT, un gruppo della superfamiglia delle immunoglobuline implicato nella comunicazione tra epitelio e sistema immunitario e nella regolazione dei fenotipi dei linfociti residenti nei tessuti. L’espressione di Skint8 è associata all’omeostasi immunitaria nelle superfici di barriera, con un potenziale impatto sui contesti di riconoscimento dell’antigene, sulle reti di segnalazione delle citochine e sui programmi di differenziazione o mantenimento di sottopopolazioni specializzate di cellule T all’interno dell’epitelio. La deregolazione delle vie legate alla famiglia SKINT è di interesse per studi su infiammazione cutanea e mucosale, difesa dell’ospite e meccanismi di disregolazione immunitaria rilevanti per l’autoimmunità e la sorveglianza immunitaria antitumorale. L’editing o la perturbazione del gene Skint8 in modelli murini consente di interrogare funzionalmente circuiti immunoregolatori intrinseci delle cellule epiteliali, la biologia delle interazioni cellula-cellula e la mappatura delle vie di segnalazione in flussi di lavoro di immunologia e ricerca dermatologica.

Skint8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Skint8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Skint8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Skint8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Skint8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Skint8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Skint8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Skint8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Skint8 nelle cellule tumorali con espressione di Skint8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.