SHIP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400619-ACT

INPP5D codifica SHIP-1 (inositolo 5-fosfatasi 1 contenente il dominio SH2), un regolatore negativo della segnalazione dei fosfoinositidi arricchito nelle cellule ematopoietiche, che defosforila PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2. Modulando il reclutamento e l’attivazione di AKT e di effettori correlati dipendenti da PIP3, SHIP-1 regola finemente la segnalazione a valle dei recettori immunitari, inclusi i recettori Fc, i recettori per le citochine e le vie del recettore delle cellule B, influenzando sopravvivenza cellulare, proliferazione, chemiotassi e risposte infiammatorie. Questo nodo regolatorio si interseca con le reti di segnalazione PI3K–AKT, MAPK e dell’immunità innata che determinano gli stati di attivazione delle cellule mieloidi e linfoidi. Alterazioni dell’attività e dell’espressione di INPP5D/SHIP-1 sono state associate a segnalazione immunitaria aberrante e a fenotipi legati all’infiammazione, supportandone l’uso in studi meccanicistici dell’omeostasi immunitaria e dei circuiti di segnalazione rilevanti per la malattia.

SHIP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INPP5D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SHIP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INPP5D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INPP5D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SHIP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INPP5D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SHIP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SHIP-1 nelle cellule tumorali con espressione di INPP5D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.