SETD2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433485-ACT

Setd2 codifica la metiltransferasi istonica SETD2 del topo, il principale enzima responsabile della trimetilazione della lisina 36 dell’istone H3 (H3K36me3) lungo i corpi genici attivamente trascritti. Questo marcatore della cromatina coordina l’allungamento della trascrizione, la processazione dell’RNA co-trascrizionale, la fedeltà della replicazione del DNA e la riparazione del danno al DNA legata alla ricombinazione omologa, contribuendo a mantenere la stabilità del genoma. SETD2 metila anche substrati non istonici, come l’α-tubulina, collegandola all’organizzazione del citoscheletro e alla regolazione mitotica. La deregolazione del controllo epigenetico dipendente da SETD2 è ampiamente rilevante per studi sulla trasformazione oncogena, sullo stress replicativo e sull’utilizzo aberrante delle vie di riparazione del DNA nelle cellule dei mammiferi.

SETD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Setd2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SETD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Setd2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Setd2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SETD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Setd2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SETD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SETD2 nelle cellule tumorali con espressione di Setd2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.