SC35 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417676-ACT

L’SRSF2 (SC35) umano codifica un fattore di splicing ricco in serina/arginina che si lega al pre-mRNA e coordina la selezione dei siti di splicing, la definizione degli esoni e l’accoppiamento tra trascrizione e processamento dell’RNA. SC35 partecipa all’assemblaggio dello spliceosoma e influenza programmi di splicing alternativo che modellano la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e la differenziazione, modulando la produzione di isoforme all’interno di reti geniche regolatorie. L’alterazione dell’attività di SRSF2 può rimodellare i pattern di splicing dell’intero trascrittoma, modificando la composizione dei domini proteici e la connettività delle vie di segnalazione. Un’espressione o una funzione deregolata di SRSF2 è associata a firme anomale di processamento dell’RNA osservate in molteplici stati cellulari rilevanti per la malattia, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici di fenotipi dipendenti dallo splicing.

SC35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SRSF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SC35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SRSF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SRSF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SC35. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SRSF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SC35 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SC35 nelle cellule tumorali con espressione di SRSF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.