RyR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402986-ACT

Il gene umano **RYR2** codifica il recettore della rianodina 2 (RyR2), un ampio canale di rilascio del Ca²⁺ del reticolo sarcoplasmatico/endoplasmatico che coordina l’accoppiamento eccitazione–contrazione modulando i transitori di calcio citosolico. L’attività di RyR2 integra input di segnalazione dalle vie cAMP/PKA e CaMKII e si interfaccia con il rilascio di calcio indotto dal calcio, il metabolismo mitocondriale e programmi trascrizionali a valle. Alterazioni dell’espressione di RYR2 o della regolazione del canale compromettono l’omeostasi del Ca²⁺, favorendo onde di calcio aberranti e segnali elettrofisiologici alterati nei cardiomiociti. La disfunzione di RYR2 è associata a fenotipi del ritmo cardiaco sia ereditari sia acquisiti, rendendolo un nodo chiave per studi meccanicistici sulla gestione del calcio e sulle risposte cellulari allo stress.

RyR-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RYR2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RyR-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RYR2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RYR2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RyR-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RYR2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RyR-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RyR-2 nelle cellule tumorali con espressione di RYR2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.