RNF31 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412436-ACT

RNF31 codifica un’enzima E3 ubiquitina ligasi che funge da componente catalitico del complesso di assemblaggio delle catene lineari di ubiquitina (LUBAC), promuovendo l’ubiquitinazione legata a Met1 di intermedi chiave della segnalazione. Attraverso la regolazione di NF-κB, del recettore del TNF e delle cascate di segnalazione dell’immunità innata, RNF31 contribuisce a coordinare l’espressione dei geni infiammatori, la sopravvivenza cellulare e le risposte allo stress. La sua attività influisce sulla proteostasi e sulla terminazione del segnale, plasmando le interazioni proteina-proteina dipendenti dall’ubiquitina e la stabilità dei complessi. Una funzione deregolata di RNF31 è stata associata a segnali immunitari anomali e al rafforzamento di vie oncogeniche in molteplici contesti patologici, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici delle reti di segnalazione guidate dall’ubiquitina.

RNF31 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF31 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNF31 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF31 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF31, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNF31. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF31 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNF31 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNF31 nelle cellule tumorali con espressione di RNF31 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.