RIP3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425224-ACT

Il gene murino Ripk3 codifica RIP3, una chinasi serina/treonina che funge da regolatore centrale della necrosi programmata (necroptosi) a valle della segnalazione dei recettori di morte e dell’immunità innata. Una volta attivata, RIP3 forma il necrosoma con RIPK1 e fosforila MLKL promuovendo la disgregazione della membrana, intersecando al contempo le risposte infiammatorie guidate da NF-κB e le vie legate allo stress metabolico. La segnalazione dipendente da RIP3 modella la produzione di citochine e il destino delle cellule immunitarie in contesti quali infezioni, infiammazione sterile e danno tissutale. Un’attività deregolata di RIPK3 è stata implicata in fenotipi infiammatori e neurodegenerativi, nel danno da ischemia-riperfusione e nell’infiammazione associata ai tumori, rendendo Ripk3 un nodo chiave per studi meccanicistici sulla morte cellulare e sull’immunità innata.

RIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ripk3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ripk3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ripk3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RIP3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ripk3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RIP3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RIP3 nelle cellule tumorali con espressione di Ripk3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.