RIP3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401008-ACT

Il gene umano **RIPK3** codifica la chinasi serina/treonina 3 interagente con il recettore (RIP3), un mediatore centrale della necrosi programmata (necroptosi) e della morte cellulare infiammatoria. RIP3 integra segnali a monte provenienti dai recettori di morte e dalle vie dell’immunità innata per attivare la disgregazione della membrana mediata da MLKL, intersecandosi al contempo con la segnalazione di NF-κB, il crosstalk con l’inflammasoma e le risposte allo stress metabolico. Un’attività deregolata di RIPK3 è associata a infiammazione anomala e a meccanismi di danno tissutale implicati nella neurodegenerazione, nel danno da ischemia-riperfusione, nell’immunopatologia associata alle infezioni e nella biologia del cancro. In quanto nodo di via, RIP3 viene spesso studiata per chiarire gli switch dipendenti dal contesto tra apoptosi, necroptosi e segnalazione pro-sopravvivenza.

RIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RIPK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RIP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RIPK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RIPK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RIP3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RIPK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RIP3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RIP3 nelle cellule tumorali con espressione di RIPK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.