Rieske FeS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403504-ACT

UQCRFS1 codifica la proteina ferro‑zolfo di Rieske, una subunità catalitica essenziale del complesso mitocondriale III (citocromo bc1) che trasferisce elettroni dall’ubichinolo al citocromo c tramite il suo cluster 2Fe–2S. Questa attività sostiene la fosforilazione ossidativa, il mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale e l’accoppiamento del trasporto di elettroni alla traslocazione di protoni. Influenzando l’efficienza della catena respiratoria, UQCRFS1 contribuisce alla produzione cellulare di ATP, all’omeostasi redox e alla segnalazione mitocondriale mediata dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS). La disregolazione della funzione del complesso III e l’alterata espressione di UQCRFS1 sono state associate a stress bioenergetico mitocondriale, rilevante per la ricerca su malattie neurodegenerative, cardiovascolari e metaboliche.

Rieske FeS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UQCRFS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rieske FeS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UQCRFS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UQCRFS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rieske FeS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UQCRFS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rieske FeS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rieske FeS nelle cellule tumorali con espressione di UQCRFS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.