Ribophorin I Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402286-ACT

RPN1 codifica la riboforina I, un componente essenziale del complesso oligosaccariltransferasi (OST) incorporato nella membrana del reticolo endoplasmatico rugoso, che supporta la glicosilazione N‑legata co‑traduzionale delle proteine secretorie e di membrana nascenti. Coordinando il trasferimento dei glicani e la maturazione proteica, la riboforina I contribuisce alla proteostasi del RE, al controllo qualità e al traffico lungo la via secretoria, con effetti a valle sulla segnalazione dei recettori e sulla composizione del proteoma di superficie cellulare. Alterazioni della capacità di glicosilazione del RE e la disregolazione delle subunità dell’OST sono state associate a risposte di stress cellulare e a un processamento proteico aberrante osservato in molteplici contesti rilevanti per la malattia, rendendo RPN1 un nodo utile per studiare la biogenesi delle glicoproteine. La modulazione sperimentale dell’espressione di RPN1 consente di analizzare in che modo la macchina di glicosilazione residente nel RE influenzi l’efficienza di ripiegamento, la degradazione tramite ER‑associated degradation (ERAD) e, più in generale, la stabilità del proteoma.

Ribophorin I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ribophorin I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ribophorin I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ribophorin I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ribophorin I nelle cellule tumorali con espressione di RPN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.