Rheb Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400539-ACT

Il gene umano **RHEB** codifica Rheb, una piccola GTPasi correlata a Ras che funge da principale attivatore a monte di **mTORC1**, integrando segnali di fattori di crescita e disponibilità di nutrienti per coordinare la sintesi proteica, la soppressione dell’autofagia e il metabolismo cellulare. L’attività di Rheb è controllata dal complesso **TSC1–TSC2**, che collega la segnalazione **PI3K–AKT** e le risposte allo stress energetico all’output della via di mTOR. La deregolazione della segnalazione **RHEB–mTORC1** è implicata in una crescita cellulare aberrante e nella riprogrammazione metabolica, ed è spesso studiata nel contesto della biologia del cancro e dei disturbi del neurosviluppo. In quanto regolatore prossimale di mTORC1, Rheb è ampiamente utilizzato per indagare il controllo della traduzione, la segnalazione lisosomiale e l’omeostasi adattativa allo stress.

Rheb Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RHEB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rheb Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RHEB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RHEB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rheb. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RHEB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rheb nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rheb nelle cellule tumorali con espressione di RHEB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.