Rev-erbα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401211-ACT

NR1D1 codifica per il recettore nucleare Rev-erbα, un repressore trascrizionale legante l’eme che collega l’orologio circadiano ai programmi genici metabolici e infiammatori. Rev-erbα regola componenti chiave dell’orologio e reti trascrizionali che controllano l’omeostasi di lipidi e glucosio, la funzione mitocondriale e la polarizzazione dei macrofagi attraverso interazioni con corepressori quali NCoR/HDAC3. La sua attività integra segnali provenienti dal ritmo circadiano, dalla segnalazione dei recettori nucleari e dalle vie di sensing energetico, modellando la tempistica tessuto-specifica dell’espressione genica. La disregolazione di NR1D1 è stata associata ad alterazioni della fisiologia circadiana ed è stata studiata in contesti che includono disfunzioni metaboliche, infiammazione immuno-mediata e rimodellamento trascrizionale correlato al cancro.

Rev-erbα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NR1D1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rev-erbα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NR1D1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NR1D1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rev-erbα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NR1D1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rev-erbα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rev-erbα nelle cellule tumorali con espressione di NR1D1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.