Reptin 52 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402653-ACT

RUVBL2 codifica Reptin 52 (RuvB-like 2), un’ATPasi AAA+ che svolge un ruolo nel rimodellamento della cromatina e nell’assemblaggio di complessi multiproteici che controllano la trascrizione, le risposte al danno al DNA e la progressione del ciclo cellulare. Reptin 52 partecipa alle vie della acetiltransferasi TIP60/NuA4 e del rimodellamento della cromatina INO80 e contribuisce alla maturazione, dipendente da R2TP, di assemblaggi macromolecolari, collegando la regolazione genica nucleare con la proteostasi. Attraverso interazioni con programmi trascrizionali oncogenici e con la segnalazione della risposta allo stress, la deregolazione di RUVBL2 è stata associata a proliferazione alterata, difetti nel mantenimento del genoma e fenotipi associati ai tumori. Queste caratteristiche rendono RUVBL2 un bersaglio utile per studiare il controllo epigenetico, lo stress replicativo e il cross-talk tra vie che coinvolgono MYC, WNT/β-catenina e le reti di riparazione del DNA.

Reptin 52 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RUVBL2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Reptin 52 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RUVBL2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RUVBL2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Reptin 52. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RUVBL2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Reptin 52 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Reptin 52 nelle cellule tumorali con espressione di RUVBL2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.