RBFOX3/NeuN Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402976-ACT

RBFOX3, noto anche come NeuN, codifica una proteina legante l’RNA arricchita nei neuroni che riconosce i motivi UGCAUG per regolare programmi di splicing alternativo essenziali per la differenziazione neuronale, la maturazione sinaptica e il mantenimento dell’identità neuronale. Attraverso il controllo dell’inclusione degli esoni e dell’equilibrio tra isoforme di mRNA, RBFOX3 si integra in reti post-trascrizionali che modellano la dinamica del citoscheletro, la crescita dei neuriti e l’espressione genica dipendente dall’attività. Lo splicing diretto dalla famiglia RBFOX è collegato a vie che governano l’equilibrio eccitatorio/inibitorio e la connettività neuronale, rendendo RBFOX3 un marcatore e un regolatore ampiamente utilizzato negli studi sullo sviluppo e sulla funzione del sistema nervoso. Programmi di splicing neuronale deregolati che coinvolgono i fattori RBFOX sono stati associati a meccanismi di malattie del neurosviluppo e neurodegenerative, a sostegno della sua rilevanza per modellare difetti di processamento dell’RNA in sistemi umani.

RBFOX3/NeuN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBFOX3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RBFOX3/NeuN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBFOX3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBFOX3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RBFOX3/NeuN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBFOX3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RBFOX3/NeuN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RBFOX3/NeuN nelle cellule tumorali con espressione di RBFOX3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.