RAPGEF6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403816-ACT

RAPGEF6 (noto anche come PDZ-GEF2) codifica un fattore di scambio di nucleotidi della guanina specifico per Rap che attiva le GTPasi RAP1 e RAP2 per coordinare la segnalazione “inside-out” delle integrine, il rimodellamento del citoscheletro e la dinamica delle giunzioni cellula–cellula. Attraverso la regolazione di vie dipendenti da Rap, RAPGEF6 contribuisce al controllo dell’adesione, della migrazione e della polarità cellulare in molteplici contesti tissutali. La sua attività si interfaccia con reti di segnalazione a valle di recettori che influenzano i circuiti MAPK e delle piccole GTPasi, modulando il traffico intracellulare e la segnalazione prossimale alla membrana. La disregolazione della segnalazione di Rap e dei programmi di adesione associati a RAPGEF6 è rilevante per studi sul comportamento cellulare invasivo, sul traffico delle cellule immunitarie e su altre alterazioni dell’organizzazione tissutale associate a malattia.

RAPGEF6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAPGEF6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RAPGEF6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAPGEF6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAPGEF6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RAPGEF6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAPGEF6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RAPGEF6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RAPGEF6 nelle cellule tumorali con espressione di RAPGEF6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.